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breve descrição:

 

2.1. Preparação do SDE

Os rizomas de SD foram adquiridos como erva seca da Hanherb Co. (Guri, Coreia). Os materiais vegetais foram confirmados taxonomicamente pelo Dr. Go-Ya Choi, do Instituto Coreano de Medicina Oriental (KIOM). Um espécime de referência (número 2014 SDE-6) foi depositado no Herbário Coreano de Recursos Herbais Padrão. Rizomas secos de SD (320 g) foram extraídos duas vezes com etanol a 70% (com refluxo de 2 h) e o extrato foi então concentrado sob pressão reduzida. A decocção foi filtrada, liofilizada e armazenada a 4 °C. O rendimento do extrato seco a partir dos materiais de partida brutos foi de 48,13% (p/p).

 

2.2. Análise quantitativa por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A análise cromatográfica foi realizada com um sistema de HPLC (Waters Co., Milford, MA, EUA) e um detector de arranjo de fotodiodos. Para a análise de SDE por HPLC, o primárioOO padrão de -glucosilcimifugina foi adquirido do Instituto Coreano de Promoção da Indústria de Medicina Tradicional (Gyeongsan, Coreia) esec-O-glucosilhamaudol e 4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisaminol foram isolados em nosso laboratório e identificados por análises espectrais, principalmente por RMN e MS.

Amostras de SDE (0,1 mg) foram dissolvidas em etanol 70% (10 mL). A separação cromatográfica foi realizada com uma coluna XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, EUA). A fase móvel consistia em acetonitrila (A) e 0,1% de ácido acético em água (B) a uma vazão de 1,0 mL/min. Um programa de gradiente multietapas foi utilizado da seguinte forma: 5% A (0 min), 5-20% A (0-10 min), 20% A (10-23 min) e 20-65% A (23-40 min). O comprimento de onda de detecção foi varrido em 210-400 nm e registrado em 254 nm. O volume de injeção foi de 10,0μL. Soluções padrão para a determinação de três cromonas foram preparadas na concentração final de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosilcimifugina), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisaminol) e 31,125 mg/mL (sec-O-glucosylhamaudol) em metanol e mantido a 4°C.

2.3. Avaliação da atividade anti-inflamatóriaEm vitro

2.3.1. Cultura de células e tratamento de amostras

As células RAW 264.7 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e cultivadas em meio DMEM contendo 1% de antibióticos e 5,5% de SFB. As células foram incubadas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37°C. Para estimular as células, o meio foi substituído por meio DMEM fresco e lipopolissacarídeo (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) a 1°C.μg/mL foi adicionado na presença ou ausência de SDE (200 ou 400μg/mL) por mais 24 h.

2.3.2. Determinação de Óxido Nítrico (NO), Prostaglandina E2 (PGE2), Fator de Necrose Tumoral-α(TNF-α) e produção de interleucina-6 (IL-6)

As células foram tratadas com SDE e estimuladas com LPS por 24 h. A produção de NO foi analisada medindo nitrito usando o reagente de Griess de acordo com um estudo anterior [12]. Secreção das citocinas inflamatórias PGE2, TNF-α, e a IL-6 foi determinada usando um kit ELISA (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. Os efeitos da SDE na produção de NO e citocinas foram determinados a 540 nm ou 450 nm usando um Wallac EnVision.™leitor de microplacas (PerkinElmer).

2.4. Avaliação da atividade antiosteoartriteIn Vivo

2.4.1. Animais

Ratos machos Sprague-Dawley (7 semanas de idade) foram adquiridos da Samtako Inc. (Osan, Coreia) e alojados em condições controladas com um ciclo claro/escuro de 12 horas em°C e% de umidade. Os ratos receberam dieta de laboratório e águaad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Daejeon (Daejeon, República da Coreia).

2.4.2. Indução de OA com MIA em Ratos

Os animais foram randomizados e designados para grupos de tratamento antes do início do estudo (por grupo). Solução MIA (3 mg/50μL de solução salina a 0,9%) foi injetado diretamente no espaço intra-articular do joelho direito sob anestesia induzida com uma mistura de cetamina e xilazina. Os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: (1) o grupo salina sem injeção de MIA, (2) o grupo MIA com injeção de MIA, (3) o grupo tratado com SDE (200 mg/kg) com injeção de MIA e (4) o grupo tratado com indometacina (IM) (2 mg/kg) com injeção de MIA. Os ratos receberam SDE e IM por via oral 1 semana antes da injeção de MIA por 4 semanas. A dosagem de SDE e IM usada neste estudo foi baseada naquelas empregadas em estudos anteriores [10,13,14].

2.4.3. Medidas da distribuição de peso da pata traseira

Após a indução da OA, o equilíbrio original na capacidade de sustentação de peso das patas traseiras foi rompido. Um testador de incapacidade (Linton Instrumentation, Norfolk, Reino Unido) foi utilizado para avaliar as alterações na tolerância à sustentação de peso. Os ratos foram cuidadosamente colocados na câmara de medição. A força de sustentação de peso exercida pelo membro posterior foi calculada em média ao longo de um período de 3 s. A proporção de distribuição de peso foi calculada pela seguinte equação: [peso no membro posterior direito/(peso no membro posterior direito + peso no membro posterior esquerdo)] × 100 [15].

2.4.4. Medições dos níveis séricos de citocinas

As amostras de sangue foram centrifugadas a 1.500 g por 10 min a 4°C; em seguida, o soro foi coletado e armazenado a -70°C até o uso. Os níveis de IL-1β, IL-6, TNF-α, e PGE2 no soro foram medidos usando kits ELISA da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

2.4.5. Análise quantitativa de RT-PCR em tempo real

O RNA total foi extraído do tecido da articulação do joelho utilizando o reagente TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), transcrito reversamente para cDNA e amplificado por PCR utilizando um kit TM One Step RT PCR com SYBR green (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EUA). A PCR quantitativa em tempo real foi realizada utilizando o sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EUA). As sequências de primers e a sequência da sonda são mostradas na Tabela.1Alíquotas de cDNAs de amostra e uma quantidade igual de cDNA de GAPDH foram amplificadas com a mistura mestre de PCR TaqMan® Universal contendo DNA polimerase, de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA). As condições de PCR foram 2 min a 50 °C, 10 min a 94 °C, 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C durante 40 ciclos. A concentração do gene alvo foi determinada utilizando o método comparativo Ct (número de ciclos limite no ponto de cruzamento entre o gráfico de amplificação e o limite), de acordo com as instruções do fabricante.

Preço FOB:US$ 0,5 - 9.999 / Peça

Quantidade mínima do pedido:100 peças

Capacidade de fornecimento:10000 peças por mês